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变性蛋白裂解液采用优质原料配制，对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有较强裂解作用，是经典常用的细胞组织快速裂解液。变性蛋白裂解液含有SDS，裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等下游实验，不可用于co-IP。变性蛋白裂解液中已含常用磷酸酶抑制剂。

• 细胞裂解：
  
  • 裂解液制备：每1mL冷的裂解液中加入4μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
    • 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
      
    • 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  • 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，1000×g条件离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 每5×10⁶个细胞中加入500μL冷的裂解液（每10⁶个细胞，大约10mg或10μL压积，加100μL裂解液。大约相当于6孔板的每孔加入100μL～150μL，或一个75cm2培养瓶加1mL。裂解液和细胞应充分接触。如果裂解液不足量，细胞裂解效率将会降低），混匀后，在4℃条件下振荡15～20分钟。
    
    • 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
      
    • 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
  • 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。
• 组织裂解：
  
  • 裂解液制备：每1mL冷的裂解液加入4μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    
  • 取100mg组织样本剪碎，加入1mL裂解液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
    
  • 将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡15～20分钟。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。
    
  • 上述蛋白提取物可分装后于-80℃冰箱保存备用。

• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒含有离子型去垢剂组分，破坏蛋白的结构，对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白不再保持其天然构象和活性。